多数沙眼根据乳头、滤泡、上皮角膜炎、血管翳、角膜缘滤泡、Herbert小凹等特异性体征可以作出诊断。由于睑结膜的乳头增生和滤泡形成并非为沙眼所特有，因此早期沙眼的诊断在临床病变尚不完全具备时较困难，有时只能诊断“疑似沙眼”，要确诊须辅以实验室检查。WHO要求诊断沙眼时至少符合下述标准中的2条：

1.上睑结膜5个以上滤泡。

2. 典型的睑结膜瘢痕。

3. 角膜缘滤泡或Herbet小凹。

4. 广泛的角膜血管翳。

除了临床表现，实验室检查可以确定诊断。沙眼细胞学的典型特点是可检出淋巴细胞、浆细胞和多形核白细胞，但细胞学检查的假阳性率高。

结膜刮片后行Giemsa染色可显示位于核周围的兰色或红色细胞浆内的包涵体。改良的Diff-Quik染色将检测包涵体的时间缩短为几分钟。荧光标记的单克隆抗体试剂盒检测细胞刮片衣原体抗原、酶联免疫测定、聚合酶链反应都有高度敏感和高特异性，但要求操作者较熟练的掌握操作技术，花费也昂贵。

沙眼衣原体培养需要放射线照射或细胞稳定剂（如放线菌酮）预处理，通常在生长48～72小时后用碘染色单层细胞，或通过特殊的抗衣原体单克隆抗体检测，是重要的实验室检查，但技术要求高，不能广泛应用。